arthusbio Ik00303說明書

S-Adenosyl-L-Homocysteine (SAH) ELISA Kit 3

S-腺苷-L-同型半胱安酸（SAH）ELISA Kit3

目錄號Ik00303

包裝尺寸48測試

檢測范圍15.625 nM-2000 nM

目標詳細信息

甲硫安酸是一種具有硫甲基的氨基酸，通過甲硫安酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（EC 2.5.1.6）與ATP一起轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫安酸（SAM）。SAM是50多種生物活性物質(zhì)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂、激素和神經(jīng)傳遞物等）的甲基供體。甲基在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下從SAM轉(zhuǎn)移后，形成S-腺苷高半胱安酸，去除腺苷后進一步代謝為同型半胱安酸（Hcy）。同型半胱安酸通過N5甲基四氫葉酸甲基轉(zhuǎn)移酶（EC1.1.1.68）和輔酶維生素B12催化途徑從N5甲基四氫葉酸接受甲基代謝為甲硫安酸。這是蛋氨酸循環(huán)。甲基化指數(shù)定義為SAM和SAH的比率。甲基化指數(shù)是甲基化狀態(tài)和甲基化的更好標記

能力。

SAH和Hcy將向關(guān)鍵生物分子提供甲基和從N-5甲基四氫葉酸中回收甲基的過程連接起來。蛛網(wǎng)膜下腔出血的水平將決定或反映蛋氨酸循環(huán)是否正常。因此，找到一種更好地量化它們的方法具有重要的實際意義。SAH升高可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷，這與基因組甲基化水平有關(guān)。蛛網(wǎng)膜下腔出血可能是動脈粥樣硬化的潛在生物標志物。

該免疫分析試劑盒用于測量可溶性樣本中的SAH水平。

測定原理

這種直接競爭ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）旨在測量樣品中S-腺苷-L-甲硫安酸（SAH）的水平。將與大分子共軛的SAH固定在微升板上。用移液管將標準品和樣品移入井中，然后用HRP-

添加抗SAH的共軛抗體。樣品或標準品中的游離SAH分子與微滴度板表面上的固定化SAH競爭抗體的結(jié)合位點。丟棄混合溶液并清洗每個孔后，添加TMB基質(zhì)溶液。底物溶液在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下變藍，

停車后變?yōu)辄S色

添加溶液（酸）。顏色與樣品（或標準品）中的SAH量成反比。使用微板分光光度計在450nm處測量剩余溶液（OD450）的光密度。可以通過標準生成的標準曲線計算樣本中的SAH水平。

樣品收集和儲存

1、樣品采集必須在4°C下進行。必要時，通過離心去除沉淀，并盡快測試樣品或?qū)⑵鋬Υ嬖?20°C或以下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

2、避免NaN3，因為它會使HRP失活。

程序

1、將所有試劑重新加熱至室溫，并充分混合。取出適當數(shù)量的孔，將剩余的孔放回原來的密封袋中。密封并儲存在-20°C。

2、向每個孔中加入50ul樣品稀釋劑（空白孔）、標準品和樣品。

3、制備HRP抗體溶液：用HRP抗體稀釋液按1:250稀釋HRP抗體，一周內(nèi)用完。充分混合并儲存在黑暗中。準備一周內(nèi)使用的適量。注：始終*離心HRP抗體瓶，以回收所有15-17ul HRP抗體。建議收集所有樣本，并在一周內(nèi)進行1-3次實驗，使用3.8ml HP抗體稀釋液，通過多次洗滌回收小瓶中的所有HRP抗體。

4.將50ul HRP結(jié)合抗體添加到空白wll的每個孔中。

5、將平板置于振蕩器上，搖動一段時間，使試劑混合，然后用微孔板封閉劑密封平板。將平板在37°C下培養(yǎng)1小時。

6、小心剝離密封劑，并將剩余溶液丟棄在孔中。在每個孔中添加至少300ul洗滌液，并保持該狀態(tài)30秒，然后去除洗滌液。重復(fù)這些步驟3次以完成清洗過程。或者改用自動清洗機。

7、向每個孔中添加TMB基質(zhì)和100ul混合基質(zhì)。輕輕搖晃并密封盤子。將培養(yǎng)板在37°C下無光培養(yǎng)15分鐘。

8、在反應(yīng)結(jié)束時加入50ul停止溶液。

9.在15分鐘內(nèi)測量每個孔在450 nm波長下的吸光度。根據(jù)空白井設(shè)置零。

數(shù)據(jù)處理

始終通過從測試孔的吸光度中減去空白孔450 nm（OD450）處的吸光度來清除背景。

每個孔（標準或樣品）的吸收率等于AASO，A是標準孔或樣品孔的平均吸光度，ASO是S0標準孔的平均吸光度。

創(chuàng)建標準曲線：通過繪制每個標準品在y軸上的結(jié)合率與其在x軸上濃度的對數(shù)來構(gòu)建標準曲線。使用二次多項式曲線擬合數(shù)據(jù)（r>0.99）。通過將樣品的結(jié)合速率代入標準曲線方程，可以計算樣品的SAH水平。如果樣品已稀釋，則乘以稀釋程度。

筆記

1、在未預(yù)熱或環(huán)境溫度低于20°C的情況下使用試劑和樣品可能會導(dǎo)致OD450讀數(shù)降低。

2、洗井后額外干燥可能會對結(jié)果產(chǎn)生負面影響，例如標準曲線較差，重復(fù)性較差。為了避免這種情況，請在清洗后立即執(zhí)行下一步。

3、充分混合溶液并*清洗，因為這些程序會影響分析。

4、用微板封閉劑密封板，孵育板時避光。

5、推薦使用標準和樣品的重復(fù)井，建議使用二次多項式進行標準曲線擬合（R2>0.99）。

質(zhì)控瓶的檢測濃度應(yīng)在檢測范圍內(nèi)。

6、濃縮洗滌液可能形成晶體。將其加熱，使鹽在稀釋前*溶解。

7、每次使用后應(yīng)處理微孔板密封劑，以避免交叉污染。

HRP基板（TMB）應(yīng)保持在黑暗中。

9、停止溶液為稀硫酸。避免直接接觸皮膚和其他物品。

儲存和到期

儲存條件：除HRP基質(zhì)和停止溶液儲存在2-8°C外，所有其他成分和板條均可冷凍儲存。

有效期：自裝運之日起冰箱儲存約6個月。如果不打算很快使用，用戶可以將分析板，

HRP抗SAM抗體、標準品、HRP抗體和樣品稀釋液在冷凍柜中儲存更長時間或/和更好的結(jié)果。